人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)ELISA KIT

双抗体夹心法 人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)ELISA KIT是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。利用产生颜色以及颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系来检测未知样品的种类及浓度。 人 用于测定血清、血浆及相关液体样本。 用于科研ELISA试剂盒实验。 用于检测人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的免疫活性：在磷脂酰肌醇蛋白聚糖3真核表达载体的构建及在细胞中表达实验中用PCR技术扩增GPC3基因,利用酶切位点将该序列插入p3XFLAG-CMV-14载体,构建p CMV-gpc3表达载体。通过脂质体将该载体转染至HEK293细胞中,利用Western blot技术检测最终结果。收集稳定表达的细胞,破碎,通过亲和层析柱,获得纯度较高的GPC3蛋白。 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)水平。用纯化的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)含量。   1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。   1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。 4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。 8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。     可检测样本中人的GPC3，且与其类似物无明显交叉反应。 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3）是一种蛋白质，由GPC3基因编码。GPC3基因位于X染色体（Xq26）上，其中最常见的基因（异构体2）编码一个70kDa的核心蛋白，有580个氨基酸。已检测到三个变体，其编码的交替拼接形式被称为异构体1、异构体3和异构体4。GPC3的蛋白核心由两个亚单位组成，其中N端亚单位的大小约为40kDa，C端亚单位的大小约为30kDa。在哺乳动物中已经发现了6个glypicans（GPC1-6）。细胞表面的硫酸肝素蛋白多糖是由一个膜相关的蛋白核心与数量不等的硫酸肝素链替代组成。糖蛋白相关整体膜蛋白多糖家族（GRIPS）的成员包含一个核心蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇连接固定在细胞质膜上。这些蛋白可能在控制细胞分裂和生长调节中发挥作用。