抗体纯化用哪种？常用方法大盘点，一看就懂

抗体纯化是依据抗体自身的生物学特性，如分子电荷、分子量大小、疏水性等，选择适配方法并通过多步层析技术，从复杂混合物中分离出目标抗体的过程。常用方法包括Protein A/G 亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水作用层析等，可最终获得高纯度抗体。其中，亲和层析仅需一步快速捕获，通常就能满足纯度与产量要求；若需进一步去除杂质、精制抗体或其片段，可搭配其他方法深度纯化。具体纯化方案的选择，主要取决于抗体来源、实验周期、成本预算及最终应用场景。

1、辛酸-硫酸铵沉淀法

在微酸性条件下，辛酸与血清或腹水中的其他蛋白质结合并使其沉淀，而IgG抗体则保留在上清液中。这是因为辛酸会破坏杂蛋白的水化膜，促使其析出，而 IgG 因自身结构特点，不易被辛酸沉淀。

沉淀的选择性、产量、纯度和重现性取决于几个因素，包括时间、温度、pH值和盐的添加速率。硫酸铵沉淀可以为某些抗体应用提供足够的纯化效果；然而，在大多数情况下，它作为柱层析或其他纯化方法之前的初步纯化步骤。

2、亲和层析法

Protein A 能高效结合人、小鼠、兔、猪、犬等多种哺乳动物的 IgG，对人源 IgG1、IgG2、IgG4 亚型亲和力极高，但与 IgG3 结合较弱。相比之下，Protein G 对多数哺乳动物 IgG 的亲和力更强、结合谱更广，可有效结合人 IgG3、小鼠 IgG1、大鼠 IgG2a 等 Protein A 难以识别的抗体类型。重组 Protein G剔除了白蛋白结合位点与细胞表面结合位点，大幅降低非特异性吸附，显著提升抗体纯度，已成为纯化无法与 Protein A 高效结合的哺乳动物单克隆 / 多克隆 IgG 的重要工具。

3、抗原亲和纯化法

离子交换层析依据蛋白质在特定缓冲体系中的净电荷差异进行分离，利用带正电或负电的层析树脂与蛋白结合。抗体属于蛋白质，由两性电解质氨基酸构成，其侧链上的酸性 / 碱性基团可在特定 pH 缓冲液中发生电离，使分子整体带电。等电点（pI）是离子交换层析条件选择的核心依据，该方法按固定相电荷性质分为阴离子交换层析和阳离子交换层析两类。

4、离子交换层析法

离子交换层析依据蛋白质在特定缓冲体系中的净电荷差异进行分离，利用带正电或负电的层析树脂与蛋白结合。抗体属于蛋白质，由两性电解质氨基酸构成，其侧链上的酸性 / 碱性基团可在特定 pH 缓冲液中发生电离，使分子整体带电。等电点（pI）是离子交换层析条件选择的核心依据，该方法按固定相电荷性质分为阴离子交换层析和阳离子交换层析两类。

当抗体处于低于其等电点的pH环境中时，它们主要发生碱性解离，以带正电荷的阳离子状态存在，可与阳离子交换剂结合。相反，当抗体处于高于其等电点的pH环境中时，它们主要发生酸性解离，以带负电荷的阴离子状态存在，可与阴离子交换剂结合。由于待分离物质与离子交换基团的亲和力不同，通过逐步调节缓冲液的 pH 与离子强度，即可实现抗体与杂质的有效分离。

5、疏水相互作用层析法

随着溶液中盐浓度的增加，疏水相互作用增强。因此，大多数疏水相互作用层析过程涉及在高盐浓度条件下上样，并在低盐浓度条件下进行洗脱。疏水作用层析介质的核心特点是疏水性较弱，与蛋白质的相互作用温和，因此能最大程度维持生物大分子的天然构象与生物活性。同时，疏水作用层析还擅长从大体积样品中富集低丰度的目标蛋白。

凝胶过滤层析法，又称尺寸排阻层析或分子筛层析，是抗体纯化中依据分子大小差异实现分离的常用技术。该方法以多孔凝胶颗粒作为固定相，让溶液中的分子按尺寸大小实现分离。当样品流经层析柱时，分子量较大的抗体无法进入凝胶孔隙，会被快速洗脱；而小分子杂质可进入凝胶内部，迁移速度更慢、洗脱滞后，借此实现抗体与杂质的有效分离。该方法分辨率虽低于亲和层析等特异性纯化技术，但具备操作简便、条件温和、适用范围广等优势。

6、凝胶过滤层析法

凝胶过滤层析法，又称尺寸排阻层析或分子筛层析，是抗体纯化中依据分子大小差异实现分离的常用技术。该方法以多孔凝胶颗粒作为固定相，让溶液中的分子按尺寸大小实现分离。当样品流经层析柱时，分子量较大的抗体无法进入凝胶孔隙，会被快速洗脱；而小分子杂质可进入凝胶内部，迁移速度更慢、洗脱滞后，借此实现抗体与杂质的有效分离。该方法分辨率虽低于亲和层析等特异性纯化技术，但具备操作简便、条件温和、适用范围广等优势。

总结：怎么选最适合你的方法？

• 追求低成本、快速粗提：选辛酸硫酸铵沉淀

• 常规科研抗体：首选 Protein A/G 亲和层析

• 特殊抗体 / 无 Fc 段抗体：用 Protein L

• 高特异性诊断抗体：用抗原亲和纯化

• 精细除杂、保活性：搭配离子交换 + 疏水层析

• 脱盐、换液、除聚合体：凝胶过滤层析

抗体纯化没有单一万能方法，多级组合、由粗到精，才能稳定获得高纯度、高活性、适配场景的优质抗体。

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