IPS诱导胰岛类器官培养攻略

一、实验准备

1、hPSC诱导分化胰岛类器官试剂盒（abs90131-1kit）

产品组成：

2、辅助试剂

3、实验耗材

二、诱导流程图

三、试剂盒使用流程：

①EB 形成（2 天）

1、hPSC 于基质胶包被的标准透明6孔板的一个孔，加入2mLAdvance 人多能干细胞培养基，使细胞生长至 70-80%汇合度。

2、将孔中的培养基吸除。

3、在消化期间配置EB形成完全培养基：取 11mL EB 形成培养基与 22μL EB 形成补充剂混匀获得 EB 形成完全培养基，于一个新的超低吸附 6孔板的 3 个孔每孔加入 2mL EB 形成完全培养基，准备后续使用。

4、向孔中加入 1mL PBS（无钙镁离子）洗，吸去。

5、向孔中加入 1mL accutase，37℃消化 3min。

6、当看到克隆发白发亮，轻轻拍打板侧（每侧拍两下），把细胞拍下来，再在生物安全柜中，加入 1mL EB 形成完全培养基终止消化，把这 2mL 体系吸入装有 3mL EB 形成完全培养基的15mL 离心管离心 160g 5min，吸弃上清至剩余几十微升，轻弹管底 3-4 下，让细胞沉淀溶于上清。

7、往管里加 1mL EB 形成完全培养基，轻弹 3-4 下，混匀即可，把这1mL细胞悬液平均悬空加入提前准备的超低吸附 6孔板3 个孔中，37℃、5%CO2过夜。

8、第二天（D-1）镜下观察可以看到形成大量、均一的 EB，半数换液，补充 50%EB 形成培养基（不含补充剂），置于水平摇床培养。（注意：所用培养基均应提前在工作台放置 30min以恢复室温，后面操作同理。）

②DE 诱导（5 天）

9、D0，解冻补充剂 A，将基础培养基 1 与补充剂 A 混匀，作为 DE 诱导培养基，恢复室温。

10、吸出孔中 EB 形成培养基，注意不要将 EB 吸出。

11、每孔加入 2mL DE 诱导培养基，放入 37℃，5%CO2的培养箱继续培养。

12、每天更换 DE 诱导培养基，持续 5 天。

③PE 诱导（6天）

13、D5，解冻补充剂 B，将基础培养基 2 与补充剂 B 混匀，作为 PE 诱导培养基。每孔每天更换 2mL PE 诱导培养基，操作如 9、10，持续 6 天。

④EP 诱导（5天）

14、D11，解冻补充剂 C，将基础培养基 3 与补充剂 C 混匀，作为 EP 诱导培养基。每孔每天更换 2mL EP 诱导培养基，操作如 9、10，持续 5 天。

⑤胰岛类器官成熟阶段（以20天为例）

15、D16，解冻补充剂D，将基础培养基4与补充剂D混匀，作为胰岛类器官成熟培养基。每孔每天更换2mL成熟培养基，操作如 9、10，持续20天。

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