ELISA试剂盒试验结果操作

1 、ELISA试剂盒的准备

临床评估特异性、敏感性、稳定性较高且在有效期内才有使用价值。不同试剂敏感性、特异性不尽相同，有报道不同酶标板孔间 A 值差大小可达 15%，标记酶的活性及显色液的稳定性也相差较大，所以合理有效的试剂选择尤为重要，对ELISA试剂盒应正确选择，定期评价并建立科学的接收标准，结合常规血液筛查情况，对实际的均一性、适用性、稳定性，选出灵敏度、特异度及精密性合适的试剂保证检测结果的准确。有报道不同-IgG 配制成的抗 HCV-cAg 酶结合物溶液对检测结果有区别，配制抗 HCV-cAg 酶结合物溶液前应检测小鼠-IgG 与产品的适配性。其次试剂盒的储存方式、运输条件及有效期均为影响检测结果的重要因素，试剂盒一般 2~8℃冰箱保存，注意不要紧贴冰箱储存室后壁以防止试剂冻结失效，可避免使用时试剂受温差影响导致酶标板上凝集小水珠及反应出现温差而影响抗原抗体的反应。使用前需将试剂盒放置 37℃恒温箱温育30min，且不同、不同批号的试剂不能混合使用。剩余试剂应及时放入干燥剂密封保存在 2~8℃冰箱，试剂打开后一周内有效，同时注意做好室内质检，确保实验结果的可靠性。

不同方法学的检验试剂会使乙肝两对半结果出现不同，如临床操作中电化学检测 HBsAg 呈阳性，而采用 ELISA 检测则呈阴性，此外，使用单抗或多抗试剂对检测结果同样造成一定的影响。研究表明ELISA试剂盒检测细胞因子时需要根据检测的细胞因子选择不同的裂解液进行处理，避免裂解液对细胞因子产生影响导致假阴性结果。

2、 样本的采集、保存及预处理

标本的运输及保存、检测人员的自身素质均可能对检测结果造成不良影响，为避免出现错误样品应准确标明编号、种类、受检者姓名及采集时间，收集后认真核对，拒收不符合要求的标本及申请单，严格按照拒收制度处理，同时处理合格标本，做好后续工作，避免延误导致标本出现溶血等其它不良情况。标本的预处理对检测结果有非常明显的影响，临床工作中有时为了快速得出检测结果在血液开始凝固前强行离心分离血清，血清中残留的纤维蛋白丝对实验结果造成影响，标本离心需*且必须待血液凝固后方能分离血清，也可在标本采集时使用带分离胶的采血管提取，使用未混入保存液的血液做检测标本。在此过程中保证待检标本新鲜、避免细菌污染，否则易出现假阳性结果，若不能及时检测可将分离的血清于 4℃保存，超过一周于-20℃保存，避免反复冻融，防止出现假阴性结果。若血清中含有类风湿因子或免疫复合物也将造成假阳性结果。

3、加样ELISA试剂盒

加样时应垂直将样本准确加入微孔底部，注意避免吸头碰到酶标板上的包被物，尽量慢吸快放，防止溅出或产生气泡，避免液体外溅使血清残留在反应壁上。每次吸样注意更换吸头，做到一样一吸头，避免交叉污染，干吸头每次加样前在血清中抽吸三次保证吸样准确，滴加试剂时建议先将滴瓶摇匀挤去第一滴再加样。加样前先将微孔板平放在板架台上，以免对洗板机的自动操作带来影响，为了保证加样的准确性，建议使用准确性高的微量移液器且定期进行校正。加样品稀释液、酶结合物应用液、底物应用液及终止液时可采用定量多道加液器，迅速完成加液过程，加样后用不干胶或胶带纸封好酶标板防止水分蒸发或杂物进入孔内，注意封板膜不可二次利用，避免交叉污染，剩余的微孔板、不干胶或胶带纸与干燥剂一同保存在备用自封塑料袋中。大批量检测大型机构体检标本时可采用直接加入适量血清的加样模式，经济环保提高工作效率。

在实际操作过程中，待检标本和酶标志物先后顺序加入，于是在竞争法中因为两者的不同时加入而存在一个“bu公平”竞争现象，研究表明，竞争法ELISA试剂盒检测受加样方法的影响存在统计学意义，将标本和酶标志物先在试管中等量混和均匀后再加入酶标板小孔杯中可降低抗-HBc 检测的假阳性率。