人源化抗 TfR1 纳米抗体：中枢神经系统药物跨血脑屏障递送的新型载体开发

一、血脑屏障与中枢神经系统药物递送的核心问题

血脑屏障是中枢神经系统维持内环境稳定的重要结构，其主要由脑内皮细胞间的紧密连接构成，可限制大分子物质进入脑组织，这一结构特征直接成为中枢神经系统疾病药物递送的主要限制因素。转铁蛋白受体 1 在脑内皮细胞中呈高表达状态，可介导结合铁离子的转铁蛋白完成跨血脑屏障转运，是受体介导跨转运途径中具备应用潜力的生理通路。

当前基于转铁蛋白受体 1 的靶向递送策略存在明确应用缺陷，转铁蛋白受体 1 是机体铁代谢核心蛋白转铁蛋白的主要结合受体，靶向分子对该受体的结合会干扰转铁蛋白与受体的正常相互作用，进而影响细胞对铁的正常摄取，引发神经毒性相关风险。因此开发不会干扰转铁蛋白生理功能，同时具备高效跨血脑屏障能力的转铁蛋白受体 1 靶向递送载体，是该研究领域需要解决的关键科学问题。

二、研究核心目标

本研究围绕转铁蛋白受体 1 靶向递送载体开发，设定四项核心研究目标，分别为从免疫羊驼体内分离获得靶向人转铁蛋白受体 1 的单域骆驼纳米抗体；通过人源化改造与算法优化，提升纳米抗体的人源化水平、溶解性与结构稳定性；验证所得纳米抗体具备跨血脑屏障能力，且不会影响转铁蛋白的正常生理功能；系统评估人源化纳米抗体作为脑部药物递送载体的安全性与应用有效性。

三、研究技术方案与实验流程

（一）靶向纳米抗体的筛选与制备

研究采用噬菌体展示技术完成靶向人转铁蛋白受体 1 纳米抗体的筛选工作。将人转铁蛋白受体 1 抗原包被于经 BSA 封闭的孔板，通过三轮淘选完成特异性噬菌体的富集。随后通过离体 ELISA 方法对 470 个单克隆进行筛选，确定具备转铁蛋白受体 1 特异性结合能力、且非特异性结合 BSA 水平极低的阳性克隆。筛选得到的纳米抗体在大肠杆菌非终止密码子抑制菌株中完成表达，通过 His-tag 亲和层析的方式完成蛋白纯化。

（二）纳米抗体的人源化与亲和力优化

研究借助计算生物学与人工智能优化算法，对纳米抗体进行定向改造，改造方向包括提升抗体人源化程度以降低免疫原性，增强抗体溶解性与结构稳定性，优化抗体与抗原的结合动力学参数。采用表面等离子共振技术对抗体结合动力学进行定量检测，通过 1:1 朗格缪尔模型计算抗体与抗原的平衡解离常数。

（三）体外功能验证实验

通过流式细胞术开展结合特异性检测，实验选用瞬时转染人、小鼠、大鼠转铁蛋白受体 1-EGFP 的 HEK293T 细胞，以及稳定表达人转铁蛋白受体 1 的 HEK293 细胞系，验证纳米抗体对不同物种转铁蛋白受体 1 的结合特异性。

开展竞争性结合实验，采用流式细胞术检测纳米抗体对 FITC 标记转铁蛋白结合受体的抑制率，评估二者的竞争结合关系。同时利用 pHrodo™ Red 标记转铁蛋白进行活细胞成像，借助 Incucyte 实时细胞分析系统监测转铁蛋白的受体介导内吞过程，判断纳米抗体对细胞正常摄取转铁蛋白的干扰作用。

（四）体内药效与安全性评价

动物实验选用转铁蛋白受体 1 基因人源化敲入大鼠模型，通过静脉注射与皮下注射两种方式给药，采用 ELISA 与 MSD 电化学发光技术检测大鼠血清、脑组织匀浆及脑脊液中纳米抗体的浓度。通过伊文思蓝染色评估血脑屏障完整性，利用葡聚糖密度梯度离心完成脑组织血管组分与脑实质组分的分离，结合免疫组化检测明确纳米抗体在脑组织内的分布特征。

四、研究关键成果

经优化后的抗人转铁蛋白受体 1 纳米抗体，与抗原的平衡解离常数达到皮摩尔级别，具备高亲和力结合特性。竞争结合实验与实时内吞检测结果证实，优选纳米抗体不会干扰转铁蛋白与转铁蛋白受体 1 的正常结合及内吞过程。在基因人源化大鼠模型中，该纳米抗体可有效跨越血脑屏障，脑脊液与血清中药物浓度比值维持在 1.0-1.5 之间。将抗 TNFα 纳米抗体与该转铁蛋白受体 1 靶向纳米抗体构建异源二聚体，可实现治疗性分子跨血脑屏障递送并进入脑实质。安全性检测结果显示，给药后大鼠血脑屏障结构完整，实验过程中未观察到明显神经毒性反应。

五、技术应用价值

本研究开发的人源化抗 TfR1 纳米抗体，在保留高效跨血脑屏障能力的同时，规避了传统靶向策略干扰铁代谢的安全隐患，为抗体药物、生物大分子药物等向中枢神经系统的靶向递送提供了新型技术平台，可应用于帕金森病、阿尔茨海默病、脑肿瘤等中枢神经系统疾病的治疗药物开发，推动中枢神经系统靶向递送技术的临床转化进程。