小鼠CD8+T细胞分选培养攻略

分选原理

选用不同的生物素（biotin）标记单克隆抗体对非目的细胞（非 CD8+T 细胞）进行标记，而后通过链霉亲和素（streptavidin）标记的磁珠对非目标细胞进行清除，从而达到小鼠 CD8+ T 细胞分选的目的。分选过程需要用到磁吸分离器。

分选试剂及仪器

小鼠CD8+T细胞分选试剂盒（阴选法）(abs50129)

产品组成：

细胞磁性分离器（多功能）(abs90335）

分选方法
1、制备单细胞悬液：在 70 μm 细胞筛网上研磨脾脏，以预冷的 PBS 冲洗细胞筛网，收集细胞悬液于50mL 离心管中，500 g，离心 5 min。

2、离心结束，弃上清，加入 5 mL 红细胞裂解液（ACK），室温裂解 5 min，再加入 20 mL PBS，500 g，离心 5 min。
注意：红细胞裂解步骤可根据所用裂解液不同调整用量及时间。少量红细胞残留不会影响后续分选及细胞纯度。

3、离心完成后，弃上清，将脾细胞重悬于 PBS，细胞悬液用 70 μm 细胞筛网过滤后，计数。计数完成后，500 g，离心 5 min。
注意：细胞悬液需要过细胞筛网，以除去组织和细胞团块，否则会影响后续细胞分选纯度。

4、离心完成后，弃上清，将细胞重悬于分选 buffer 中，调整细胞密度为 1×10⁸ cells/mL。
注意：分选 buffer 为含有 2 mM EDTA 和 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 或者含有 2 mM EDTA 和 0.5% BSA的 PBS，需预先通过 0.22 μm 滤膜过滤除菌。

5、将 100 μL 细胞悬液（1×10⁷个细胞）加入无菌流式管底部，再加入 2 μL Biotin-Antibody Mix，混匀后4°C 孵育 10 min。
注意：加入细胞悬液时将细胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根据所使用磁力架不同也可使用离心管进行细胞分选。如果分选更多细胞，则按比例增加 Biotin-Antibody Mix 的用量。

6、孵育完成后，在流式管中加入 20 μL 清洗过的 Streptavidin（磁珠使用前需要用分选 buffer 进行清洗：涡旋振荡重悬磁珠，吸取实验需要的磁珠至 1.5 mL 离心管，加入 1mL 分选 buffer，10000 g 离心 1 min，弃上清。加入 1 mL 分选 buffer 重复洗涤磁珠 1 次后用与原来相同体积的分选 buffer 重悬磁珠。如吸取 20 μL 磁珠进行清洗，则清洗后用 20 μL 分选 buffer 进行重悬），混匀后 4°C孵育 10min。
注意：如果分选更多细胞，则按比例增加 Streptavidin 用量。例如分选 5×10⁷ 个细胞，在 500 μL 细胞悬液中加入 10 μL Biotin-Antibody Mix 和 100 μL Streptavidin。如果分选少于 1×10⁷ 个细胞，则将细胞悬液体积补至 100 μL，使用 2 μL Biotin-Antibody Mix 和 20 μL Streptavidin。

7、孵育完成后，在流式管加入 2.5 mL 分选 buffer，用移液器上下混合吹打 5 次混匀（避免剧烈振荡或者上下颠倒混匀）。

8、将含有细胞的分选流式管置于磁力架上，静置 5 min。

9、将细胞悬液轻柔倒入一个无菌离心管中（倾倒过程中流式管不要脱离磁力架），此细胞悬液中即包含纯化的小鼠 CD8+ T 细胞，500 g，离心 5 min。离心后弃上清，收集细胞。

10、根据实验需要洗涤细胞后，将细胞重悬于所需缓冲液或培养基中，即可用于后续分子生物学或细胞生物学实验。

分选效果：
从 C57BL/6 小鼠脾脏细胞中分选 CD8+ T 细胞，分选前后的细胞用 FITC anti-mouse CD8 抗体（克隆号 53-6.7）标记后进行流式细胞仪分析，分选前后的 CD8+ T 细胞纯度分别为 13.8%和 97.1%。

从C57BL/6小鼠脾脏细胞中分选CD8+T细胞，用FITC标记的 anti-mouse CD8抗体（克隆号53-5.8）染色后进行流式细胞分析。 结论：分选前后的CD8+细胞纯度分别为8.9%和95.1%

培养原理

如果不需要对分选后的选CD8+T进行大规模扩增，可选用小鼠脾脏CD8+T细胞专用维持培养基（abs90125）进行维持培养，能维持细胞3-5天的代谢活性。

如果需要对分选后的选CD8+T进行大规模扩增，需要下面的扩增体系：

小鼠脾脏CD8+T细胞专用维持培养基（abs90125）+Anti-Mouse CD3/CD28 Monoclonal Antibody Beads（Activation）（abs160030）

磁珠可以简单快捷的活化及扩增T 细胞，无需饲养层细胞（抗原递呈细胞）或抗原。磁珠为直径 5 µm 的惰性超顺磁珠，大小与抗原呈递细胞相似，同时共价偶联抗CD3 和抗CD28 抗体。活化或扩增后，磁珠可以通过磁力架轻松去除。

培养步骤

一、试剂配置
1、清洗 buffer：含有 2 mM EDTA 和 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 或者含有 2 mM EDTA 和 0.5% BSA 的PBS，需预先通过 0.22 μm 滤膜过滤除菌。
2、小鼠脾脏CD8+T细胞专用维持培养基（abs90125）；

3、Anti-Mouse CD3/CD28 Monoclonal Antibody Beads（Activation）（abs160030）；

注意：取用 T细胞激活磁珠前彻底重悬磁珠（如涡旋>30 秒，或置于旋转仪 5 分钟），吹打时避免产生气泡。进行流式检测前，使用磁力架去除磁珠（可以通过轻柔吹打释放结合在细胞上的磁珠），收集上清液，进行下一步的流式检测。

二、操作步骤
1、清洗磁珠：
（1）彻底重悬试管中的磁珠（如涡旋>30 秒，或置于旋转仪 5 分钟）。
（2）吸取目标体积的磁珠至流式管中，加入同等体积的清洗 Buffer。若使用的磁珠体积不足 1 mL，添加 1 mL的清洗 Buffer，涡旋 5 秒，或使用移液器吹打混匀，注意避免产生气泡（此处也可直接使用细胞培养基清洗）。
（3）将流式管置于磁力架上 3 分钟，弃上清。
（4）重复步骤 2-3，本次使用细胞培养基对磁珠再次清洗。共清洗磁珠两次。
（5）使用细胞培养基重悬磁珠（比如：吸取 25 μL 磁珠进行清洗，25 μL 磁珠可用于 96 孔板的 10 个孔进行 T细胞激活实验。清洗后用 1 mL 细胞培养基进行重悬，进行细胞激活时，每 100 μL 磁珠悬液加至 96 孔板的一个孔中）。

2、小鼠 T 细胞的激活：（以 96 孔板为例）
（1）调整 T 细胞浓度为 1 x 10⁷ cells/mL，每孔中加入 25 μL 细胞悬液，此时孔内含有 2.5 x 10⁵ 个 T 细胞，再向孔内添加 75 μL 细胞培养基，保持孔内总体积为 100 μL。
（2）向孔中加入 100 μL 清洗后重悬的磁珠，此时磁珠和细胞的数量比例为 1：1，孔内液体总体积为 200 μL。使用移液枪轻轻吹打混匀孔内的磁珠和细胞。
（3）将细胞培养板置于 37℃，5% CO2培养箱中培养，根据实验需要决定细胞的培养时长。
（4）激活 24 小时至 48 小时内，收获激活的 T 细胞，用于下游实验分析。

3、小鼠 T 细胞的扩增：
（1）按照以上步骤激活 T 细胞，在加入磁珠的 48 小时检测 T 细胞的激活情况。细胞状态良好时，对细胞进行轻柔吹打、传代（若细胞增殖较慢，可对细胞半量换液：小心吸弃 100 μL 上清液，再向孔内添加 100 μL 新鲜细胞培养基，轻柔吹打混匀细胞，继续培养 1-2 天后传代）。
（2）细胞与磁珠置于 37℃，5% CO2 培养箱中培养，根据实验需要决定细胞的培养时长。
（3）每日或每隔两日查看细胞扩增情况，小鼠 T 细胞扩增形态表现为镜下可见的增殖聚团，正常情况下 T 细胞在激活后第 4-12 天表现出较快的增殖速度。当细胞皱缩或增殖速度明显放慢时，提示细胞可能耗竭。
注意：在细胞激活的 48 小时内不要处理细胞。2 天后随时观察细胞状态，当培养基变黄或孔内细胞数量过多时换液或传代。（推荐定期进行细胞计数，当细胞密度超过 2.5x10⁶cells/mL 时，轻柔吹打混匀，将细胞密度调整为 0.5-1 x 10⁶cells/mL。）

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎入群交流哦！

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