abinScience助力揭秘老牌中药脑震宁通过槲皮素-叶黄素-HMOX1轴精准抑制反复脑震荡后神经元铁死亡

创伤性脑损伤（TBI）全球每年影响约6900万人，其中轻度创伤性脑损伤（mTBI）占比高达80%-90%。反复轻度创伤性脑损伤（rmTBI）作为常见类型，可引发头痛、抑郁、记忆缺陷等持续性症状，且显著增加帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病的发病风险。目前，rmTBI 的病理机制尚未完全明确，临床缺乏治疗手段。铁死亡是一种铁依赖的程序性细胞死亡，以脂质过氧化物和活性氧（ROS）积累为特征，其形态学表现与 rmTBI 的神经元损伤存在诸多相似性。脑震宁作为 1976 年研制的中药复方，临床已证实对脑损伤相关病症具有疗效，动物实验也显示其可改善线粒体功能、保护髓鞘和轴突，但针对 rmTBI 的活性成分及作用机制仍不明确。发表于《Phytomedicine》的研究“Mechanisms of Naozhenning in Inhibiting Neuronal Ferroptosis and Alleviating Brain Recurrent Mild Traumatic Brain Injury in a Rat Model”通过构建大鼠反复脑震荡（MCC）模型，结合多种实验技术，系统探究铁死亡在 rmTBI 中的作用及脑震宁的神经保护机制。

研究通过自由落体撞击法构建 MCC 模型，设置 70cm、110cm、150cm 三种撞击高度，以 Morris 水迷宫评估认知功能，HE 染色和 Nissl 染色观察神经元形态。结果显示，随撞击高度增加，大鼠空间学习和记忆能力显著下降，110cm 和 150cm 组逃避潜伏期较对照组显著延长（P<0.0001），各 MCC 组目标象限停留时间均显著缩短。组织学层面，海马 CA1 区神经元损伤呈高度依赖性，150cm 组神经元出现不规则三角形形态、广泛核固缩及深染，神经元数量较对照组显著减少（P<0.05）；Nissl 染色显示 150cm 组仅残留 2-3 层神经元，Nissl 体大量丢失或消失，且各 MCC 组神经元数量均显著减少（P<0.05）。此外，脑损伤标志物 Tau 蛋白和 S100β 的表达随撞击高度升高而增加，提示撞击高度越高，MCC 模型大鼠认知功能受损越严重，神经元损伤越显著，为后续确定最佳损伤条件提供依据。

在确定撞击高度影响后，研究进一步探究MCC模型中神经元铁死亡的时间动态，设置 24 小时、48 小时、7 天、14 天、21 天五个时间点，通过TEM观察超微结构，Western blot 和 qRT-PCR 检测铁死亡标志物。行为学结果显示，48 小时和 7 天组逃避潜伏期较对照组显著延长，21 天组恢复至接近对照组水平；48 小时组目标象限停留时间显著缩短，7 天和 14 天组持续降低，21 天组无显著差异。组织学观察发现，48 小时组神经元出现核固缩和深染，7 天组细胞呈三角形或不规则形，核仁模糊，7 天和 14 天组神经元数量显著低于对照组及 24 小时、48 小时组。TEM 显示，48 小时组线粒体肿胀空泡化，14 天组髓鞘分离、轴突崩解，21 天组线粒体 cristae 几乎完全消失；铁死亡标志物方面，FTH 蛋白及 mRNA 水平在 14 天降至最低后反弹，FTL 蛋白在 48 小时达峰值后逐渐下降，且 48 小时和 21 天组线粒体 cristae 丢失明显。这些结果表明，MCC 模型中 hippocampal 神经元铁死亡在 48 小时 - 7 天达到高峰，之后逐渐恢复，为脑震宁干预时间点的选择提供关键参考。

研究给予MCC大鼠低（NZN-L）、中（NZN-M）、高（NZN-H）三种剂量脑震宁干预21天，以吡拉西坦（PLXT）为阳性对照。行为学结果显示，模型组逃避潜伏期显著延长，NZN-L、NZN-M 组及 PLXT 组潜伏期较模型组显著缩短，且 NZN-L 组目标象限停留时间下降幅度最小。组织病理学观察发现，模型组神经元排列稀疏、核深染，NZN-L 组神经元排列致密，仅少数细胞核消失，神经元数量显著增加；TEM 显示，NZN-L 组神经元核膜完整、核仁可见，线粒体 cristae 保存较好，而 NZN-M 组线粒体变形、髓鞘崩解，NZN-H 组神经元严重萎缩、线粒体 cristae 几乎消失。分子水平上，模型组 GPX4 蛋白水平显著降低，NZN-M 和 NZN-H 组 FTH、FTL 蛋白水平较模型组显著降低但基因表达升高；体外实验显示，脑震宁处理组 ROS 水平显著降低，且加入 p38 抑制剂（SB203580）和 ERK 抑制剂（PD98059）后 ROS 水平进一步下降。这表明脑震宁可通过调节 MAPK 信号通路减少氧化应激，且低剂量在改善认知功能、保护神经元及线粒体结构方面效果最优，避免了中高剂量可能带来的二次损伤。

LC-HRMS 鉴定脑震宁汤剂与含药血清中关键活性成分

为明确脑震宁的物质基础，研究采用 LC-HRMS 对脑震宁汤剂及含药血清进行定性和定量分析。结果显示，汤剂中共鉴定出 509 种化合物，376 种 mzCloud 匹配得分 > 60，其中含量较高的活性成分包括丹酚酸 B、柚皮苷、没食子酸等；血清中鉴定出 211 种化合物，134 种匹配得分 > 60，其中柚皮苷、丹酚酸 B等可进入血液循环，且汤剂与血清中共有 96 种化合物。此外，汤剂中排名前十的活性成分包括 4 - 吲哚甲醛、烟酸、儿茶素等，血清中则以甘氨鹅脱氧胆酸、(+) 12 (13)-DiHOME、甘氨脱氧胆酸等为主。这些结果明确了脑震宁中可被吸收并发挥作用的潜在活性成分，为后续筛选核心药效成分提供了数据支撑。

网络药理学筛选脑震宁核心活性成分与关键作用靶点

研究结合网络药理学技术挖掘脑震宁治疗 MCC 的核心成分与靶点，通过 TCMSP 数据库筛选出脑震宁中符合口服生物利用度和类药性标准的活性成分，包括川芎 7 种、丹参 65 种、当归 2 种等，经 UniProt 数据库匹配得到 299 个独特靶蛋白。同时，从 DrugBank、GeneCards、OMIM 等数据库获取 rmTBI 和铁死亡相关疾病靶标，去重后得到 2186 个，与药物靶标交集获得 176 个核心治疗靶标。利用 Cytoscape 构建 “药物 - 成分 - 靶标” 网络，发现槲皮素、Kaempferol、叶黄素、丹参酮 IIA、丹参酮等为核心活性成分；通过 STRING 数据库构建蛋白 - 蛋白相互作用（PPI）网络，显示 TP53、JUN、AKT1、IL6、SRC、TNF 等为关键枢纽靶标，其中前 6 个靶标的度值均≥28。进一步的 GO 和 KEGG 富集分析显示，核心靶标涉及外源性刺激反应、基因表达正调控等生物学过程（BP），细胞外空间、突触后膜等细胞组分（CC），以及蛋白结合、酶结合等分子功能（MF），且显著富集于癌症通路、AGE-RAGE 信号通路、TNF 和 IL-17 信号通路等 179 条 KEGG 通路。这些结果从系统生物学角度初步揭示了脑震宁多成分、多靶点、多通路的治疗特性，为后续验证核心成分与靶点提供了方向。

槲皮素与叶黄素通过结合 HMOX1 抑制神经元铁死亡

为明确脑震宁调控铁死亡的具体机制，研究通过 KEGG 数据库筛选出 42 个铁死亡相关基因，与脑震宁核心靶标交集得到 TP53 和 HMOX1 两个关键基因。分子对接结果显示，槲皮素、Kaempferol、叶黄素可与 HMOX1 结合，其中槲皮素和叶黄素与 HMOX1 的结合能均达 -7.23±0.05 kcal/mol，提示结合稳定。为验证结合特异性，研究使用 abinScience 提供的高纯度 HMOX1 蛋白（纯度 > 90%，货号 HY063012）进行表面等离子体共振（SPR）实验，结果显示槲皮素和叶黄素均能与 HMOX1 特异性结合，且槲皮素的结合亲和力更强。体外功能验证中，以 Erastin 诱导 HT22 细胞铁死亡，Fer-1 和 HMOX1 抑制剂 Znpp 为阳性对照，结果显示 2.5μM 槲皮素或叶黄素处理可显著提高细胞活力；Western blot 检测发现，模型组 FTH、FTL 蛋白表达显著降低，而槲皮素、叶黄素处理组及 Znpp 组 FTH、FTL 蛋白水平均显著回升。这表明槲皮素和叶黄素是脑震宁抑制神经元铁死亡的核心活性成分，其作用机制依赖于与 HMOX1的特异性结合，进而调控铁死亡相关蛋白表达。

该研究首次明确铁死亡在反复轻度创伤性脑损伤病理过程中的核心作用，证实其与损伤程度和时间密切相关，在损伤后 48 小时 - 7 天达到高峰。脑震宁作为传统中药复方，能有效改善 MCC 大鼠的认知功能，减轻 hippocampal 神经元损伤和铁死亡，且低剂量效果最优，其机制与调控 MAPK 信号通路、抑制氧化应激相关。通过多技术整合分析，确定槲皮素和叶黄素为脑震宁的核心活性成分，二者可通过与 HMOX1 蛋白结合抑制神经元铁死亡，为脑震宁的临床应用提供了坚实的物质基础和机制支撑。该研究不仅揭示了 rmTBI 的新病理机制，还为开发靶向铁死亡的神经保护药物提供了新思路，也为中药复方的现代化研究提供了可行的技术路径。

abinScience提供的高纯度 HMOX1 蛋白（货号 HY063012），为靶标结合验证、通路功能确认提供了关键工具，直接支撑了 “槲皮素和叶黄素通过结合 HMOX1 抑制神经元铁死亡” 这一核心机制的阐明，为后续核心实验的开展奠定了物质基础。