代谢π析（六）——NDSRI阳性对照怎么选？从“买不到”到“选得对”

引言

在前两期文章中，我们系统探讨了双诱导仓鼠肝S9在亚硝胺类杂质遗传毒性评估中的核心价值，以及NDMA、NDEA等小分子亚硝胺阳性对照的选择策略。

然而，随着ADC药物、大分子药物的快速发展，一类更复杂的亚硝胺杂质——NDSRI（原料药相关亚硝胺杂质）正成为行业面临的新挑战。

这类杂质结构复杂、标准品难买、阳性对照不知如何选……本期「代谢π析」，我们就来拆解这个难题。

一、NDSRI是什么？为什么它让行业“头疼”？

在传统的Ames试验中，阳性对照通常选用2-氨基蒽（2-AA）、苯并[a]芘（BAP）等标准致突变物，用于验证S9代谢活化系统的活性。然而，当评估亚硝胺类化合物时，情况发生了变化（详见图1）。

（图1：NDMA/NDEA vs NDSRI 对比示意图）

NDSRI，全称Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities，即原料药相关亚硝胺杂质。它与NDMA、NDEA等小分子亚硝胺有着本质区别[1][2] （详见表1）：

（表1： 小分子亚硝胺vs NDSRI核心差异对比表）

核心痛点：NDSRI的阳性对照，不是“选哪个”的问题，而是“根本买不到”的问题。

二、监管机构怎么说？

FDA和EMA在最新指南中明确指出：对于NDSRI，由于缺乏化合物特异性数据，应基于结构相似的替代物（surrogate） 进行交叉参照评估。[1][2]

这意味着：您不需要为每一个NDSRI都合成专属标准品（虽然这是优解），但必须能够科学地论证：您选择的替代物与目标NDSRI在结构上和代谢活化路径上是相似的。

三、NDSRI阳性对照（替代物）的三大选择标准

（图2：NDSRI阳性对照选择三大标准示意图）

根据FDA指南和行业共识，选择合适的替代物需满足以下三个核心要素[5][6][9]：

标准1：结构相似性

替代物应与目标NDSRI具有相似的结构骨架和取代模式，尤其是亚硝胺官能团（N-N=O）周围的化学环境。局部结构越相似，代谢活化路径越可能一致。

标准2：有稳健的致癌性数据

替代物需有可靠的TD50值（来自啮齿动物终生生物测定），这是计算AI限值的基础数据。NDMA、NDEA、NDPA、NDBA、NNK等已知亚硝胺均有充分的数据库支持。

标准3：相似的代谢活化路径

替代物应能产生类似的重氮离子DNA反应活性。这意味着，替代物和目标NDSRI应被相似的CYP酶系（如CYP2E1、CYP2A6）代谢活化。

四、如何评估NDSRI的结构特征对致癌效力的影响？

在进行交叉参照时，需要评估NDSRI的结构特征会增强还是减弱其致癌效力[7]：

（表2：影响NDSRI致癌效力的结构特征）

实操提示：如果目标NDSRI含有多个“减弱效力”的特征，可以选择一个效力稍高的替代物（如NDEA），这样计算出的AI限值会更保守、更安全。

五、替代物选择的分层策略

5.1 优选：结构最相似且有数据支撑的替代物

对于目标NDSRI，应优先寻找局部结构相似的已知亚硝胺作为替代物，重点关注亚硝胺官能团附近的化学环境。[5]

经典案例：N-亚硝基-去甲基氯吡拉明（一种NDSRI）通过交叉参照评估，选择了4-（甲基亚硝胺基）-1-(3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）作为替代物。两者在亚硝胺核心结构周围的局部环境高度匹配，NNK具有稳健的致癌性数据（TD50=0.0999 mg/kg/day），据此可将AI从18 ng/day提升至100 ng/day。[8]

（图3：NDSRI交叉参照案例示意图）

5.2 次选：利用已知NDSRI标准品库

目前，一些CRO/CDMO公司已建立了NDSRI对照品库（如明捷医药、华测医药等）， 如果您评估的NDSRI恰好在这些库中，可直接购买使用，这是省力的方案。

5.3 可选项：利用CPCA预测结合结构分类

FDA的CPCA方法根据亚硝胺的结构特征将NDSRI分为不同效力类别，并推荐对应的AI限值[3][4][10]（详见表3）：

（表3：FDA  CPCA方法推荐的NDSRI效力分类与AI限值）

如果NDSRI的预测类别对应的AI可以接受，可能无需寻找替代物即可直接使用。

六、针对仓鼠S9用户的实操建议

作为仓鼠S9试剂的用户，您在不同场景下的阳性对照选择方案（详见表4）：

（表4：不同需求层级下的阳性对照选择方案）

核心建议：

1. 绝大多数情况下，NDMA+NDEA作为基础阳性对照是够用的——它们足以验证您的仓鼠S9批次对亚硝胺类杂质的代谢活化能力。

2. 如果客户需要针对特定NDSRI进行方法验证，建议采用“交叉参照”策略，根据目标NDSRI的结构特征选择最相似的已知亚硝胺作为替代物。

3. 如果客户面临严格的监管审查，定制合成专属NDSRI标准品是最稳妥的选择。

七、NDSRI阳性对照选择的决策流程图

（图4：NDSRI阳性对照选择决策流程图）

八、典型案例参考

案例背景：某ADC药物研发企业，在其连接子工艺中发现了1个结构复杂的NDSRI杂质。该杂质含有芳香环等，商业标准品库中无匹配项。[8]

解决方案：

1. 首先使用NDMA+NDEA验证仓鼠S9批次的亚硝胺代谢活性（阳性对照响应正常）

2. 通过交叉参照分析，选择NMBA（N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸）作为替代物——两者均含有羧酸基团，代谢路径相似

3. 利用NMBA的TD50数据计算AI限值，并采用含30%仓鼠S9的增强Ames试验进行杂质致突变性评估

结果：该方案通过了监管机构的预审，企业避免了数十万元的定制合成费用。

九、齐氏生物配套解决方案

齐氏生物不仅提供高品质的PB/BNF双诱导仓鼠肝S9产品，同时为客户提供加强Ames试验配套试剂及技术咨询服务：

结语

NDSRI的阳性对照选择，确实比小分子亚硝胺复杂得多。但只要掌握了“交叉参照”的核心逻辑，结合CPCA预测和结构特征分析，您可以在不花大价钱定制合成的情况下，找到科学、合规的解决方案。

记住三个关键词：结构相似、数据支撑、代谢匹配！

下一期「代谢π析」，我们将继续探讨仓鼠S9在更多药物杂质评估场景中的应用，敬请期待！

参考文献

[1] European Medicines Agency. Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products (EMA/409815/2020 Rev.21)[S]. 2024.

[2] U.S. Food & Drug Administration. Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs: Guidance for Industry[S]. 2024.

[3] U.S. Food & Drug Administration. Recommended Acceptable Intake Limits for Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities[S]. 2023.

[4] Schlingemann J, Burns MJ, Ponting DJ, et al. The landscape of potential small and drug substance related nitrosamines in pharmaceuticals[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2022, 112(5): 1287-1304.

[5] Nudelman R, Kocks G, Mouton B, et al. The nitrosamine “saga”: lessons learned from five years of scrutiny[J]. Organic Process Research & Development, 2023, 27(10): 1719-1735.

[6] International Council for Harmonisation. ICH M7(R2): Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk[S]. 2023.

[7] Li Y, Hecht SS. Metabolic activation and DNA interactions of carcinogenic N-nitrosamines to which humans are commonly exposed[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(9): 4559.

[8] 陈某某, 等. 缬沙坦中亚硝胺药物成分相关杂质(NDSRI)的(Q)SAR评价及Ames试验研究[J]. 中国现代应用药学, 2025.

[9] USP Nitrosamines Exchange. Enhanced Ames Test Conditions for N-nitrosamines (Q&A Rev.16)[EB/OL]. 2023. https://nitrosamines.usp.org/

[10] EFSA/WHO. Review of the Threshold of Toxicological Concern (TTC) approach and development of new TTC decision tree[R]. EFSA Supporting Publications, 2016.