小鼠骨髓单细胞悬液制备

一、实验前材料准备

① 细胞培养皿

② 75% 酒精

③ 眼科剪和镊子（或刀片）

④ 1-3 mL 注射器及针头

⑤ 70 μm或200目滤网

⑥ 15 mL或50 mL的离心管

⑦ 红细胞（RBC）裂解缓冲液

备注：如果细胞后续用于培养请将材料消毒，保证无菌。

二、小鼠胫骨与股骨获取

颈椎脱臼法处死小鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出小鼠置于操作台上，分别在盆骨髋关节上方和脚踝处剪断大腿，小心剔除骨头上的纤维及肌肉组织，即可获得小鼠胫骨与股骨。获得小鼠股骨如图1所示

_{图1. 小鼠股骨}

三、骨髓单细胞悬液制备

① 将骨头置于装有PBS或培养基的培养皿中；

② 减掉胫骨和股骨两端的关节，暴露出骨髓腔；

③ 用注射器吸取适量的PBS或培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲洗出来（必要时可反复冲洗至骨髓腔变为白色为止）；

④ 用移液器或注射器轻轻吹打细胞团，将细胞团分散；

⑤ 用70 μm或200目滤网过滤细胞，滤液收集于离心管中，300-500 g离心5 min，弃上清；

⑥ 裂解红细胞（选做：根据后续实验决定是否需要裂解红细胞）；

⑦ PBS或培养基重悬细胞，计数，调整细胞浓度为1×10⁷/mL。

_{图2. 小鼠骨髓细胞流式上机FSC/SSC实验结果}

四、注意事项

① 剥离骨头和肌肉时，骨头的两端关节一定要完整保留，剪破可能会导致细胞损失。

② 如果需要培养获取MSC，可以不裂解直接培养；如果需要利用骨髓中单核细胞分化成为巨噬或者树突状细胞，一般需要裂红。

③ 骨髓细胞如需进一步培养，请注意全程无菌操作；如果只是做普通的流式实验，则可以不考虑无菌环境。

④ 细胞计数可以使用血细胞计数板或者自动细胞计数仪来计数细胞。

⑤ 为保持细胞活性，减缓代谢，尽量全程低温操作（在冰上或4℃环境）。

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