武汉艾美捷科技有限公司

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）通过催化乙酰化蛋白中乙酰赖氨酸的水解反应，调控基因转录、细胞周期、分化及凋亡等多种关键生物学过程。HDAC6是HDAC家族中的独特成员，主要定位于细胞质，其底物包括α-微管蛋白、Hsp90及皮质蛋白等非组蛋白，在细胞骨架动力学、蛋白降解及免疫应答中发挥重要作用。HDAC6的异常表达与多种疾病密切相关，包括癌症、神经退行性疾病、炎症及自身免疫病，因此成为药物研发的重要靶点。

为满足科研人员在HDAC6活性检测、抑制剂筛选及药物发现中的需求，由艾美捷代理的BPS Bioscience公司推出的荧光法HDAC6检测试剂盒（货号：50076）提供了一套完整、灵敏、高通量兼容的解决方案。该试剂盒基于独特的荧光底物与显影剂组合，彻底摒弃了传统HDAC检测方法中涉及的放射性同位素、萃取及层析等繁琐步骤，仅需两步简单操作即可完成酶活性分析，极大地简化了实验流程。

一、检测原理：基于淬灭/去淬灭的荧光法

本试剂盒采用荧光共振能量转移（FRET）原理，具体检测流程分为两个步骤：

第一步：酶催化去乙酰化。 将荧光染料标记的乙酰化赖氨酸肽底物与纯化的HDAC6酶共同孵育。完整底物中，荧光染料因与肽链的特定相互作用而发生淬灭，此时底物几乎不发出荧光。HDAC6特异性催化水解底物中赖氨酸残基上的乙酰基，生成去乙酰化的肽产物。

第二步：显影与荧光释放。 加入赖氨酸特异性显影剂（Lysine Developer），该显影剂仅识别去乙酰化的赖氨酸残基。一旦与去乙酰化肽结合，显影剂便会释放出荧光染料，使其恢复荧光特性。荧光强度与HDAC6的酶活性成正比。

与传统HDAC检测方法相比，该试剂盒采用均相检测模式，无需放射性标记、无需有机溶剂萃取、无需色谱分离，仅需“加样-混合-孵育-读数”四个步骤即可完成检测，尤其适合高通量筛选（HTS）应用。

二、试剂盒核心组分与设计优势

1. 即用型完整组分，操作高效

试剂盒提供所有必需成分，用户无需额外准备酶或底物：

纯化的重组人HDAC6酶（GST-tag，Sf9细胞表达），保留完整催化活性。

荧光底物（Fluorogenic HDAC Substrate 3），含乙酰化赖氨酸侧链的荧光淬灭肽。

2× HDAC显影剂，含强效HDAC抑制剂Trichostatin A（TSA），兼具显影与阳性/阴性对照功能。

HDAC检测缓冲液，优化pH及离子组成，确保酶反应在最适条件下进行。

黑色低吸附微孔板（96孔或384孔，根据规格选配）。

2. 内置阳性/阴性对照：Trichostatin A

试剂盒中的2× HDAC显影剂含有Trichostatin A（TSA） ，TSA是一种广谱强效HDAC抑制剂（对HDAC6的IC50约为nM级），同时作为：

阳性对照：用于验证实验体系的有效性，确认酶活性检测系统正常工作。

阴性对照：在显影步骤中抑制任何残留HDAC6活性，确保显影信号的稳定性和特异性。

3. 96孔/384孔双规格，灵活适配不同通量

该试剂盒提供96孔（100次酶反应，货号50076-1）和384孔（384次酶反应，货号50076-2）两种规格。用户可根据实验规模灵活选择：

96孔规格：适合常规实验、方法开发及中小规模抑制剂筛选。

384孔规格：适合高通量筛选（HTS），单位反应成本更低，与自动化移液工作站完美兼容。

三、应用场景与科研价值

1. HDAC6抑制剂的高通量筛选

HDAC6选择性抑制剂（如ACY-1215、Tubastatin A）在肿瘤、神经退行性疾病及炎症性疾病中展现出治疗潜力。利用该试剂盒，研究人员可以：

在96孔或384孔板中快速筛选数千个化合物，评估其对HDAC6活性的抑制效果。

通过剂量-反应曲线测定IC50值，比较不同化合物的抑制效力。

筛选HDAC6选择性抑制剂（与其他HDAC家族成员进行正交筛选）。

2. 酶动力学研究

利用试剂盒中的纯化重组酶和底物，研究人员可以：

通过改变底物浓度，测定HDAC6的米氏常数（Km）及最大反应速率（Vmax）。

分析不同突变体（如与疾病相关的HDAC6突变）对酶活性的影响。

研究HDAC6与其他蛋白（如Hsp90、dynein）相互作用对酶活性的调节。

3. 构效关系（SAR）研究

在药物化学优化阶段，该试剂盒可用于评估系列化合物的构效关系，快速筛选出活性最优的候选化合物，指导药物设计。

4. 细胞裂解液中HDAC6活性检测

试剂盒同样适用于检测细胞裂解液中的HDAC6活性。研究人员可通过免疫沉淀或亚细胞分级分离富集HDAC6，然后使用该试剂盒定量分析不同处理条件下（如药物处理、基因敲除）的HDAC6活性变化。

四、技术参数与操作要点

规格与储存

检测格式：荧光法（96孔或384孔）。

激发/发射波长：350-380 nm / 440-460 nm。

物种：人源。

靶点：HDAC6（UniProt Q9UBN7）。

运输温度：-80°C（干冰）。

稳定性：按照指示储存，试剂盒在收货后6个月内保持最佳性能。试剂盒各组分储存条件不同，请务必根据说明书存放。

监管状态：仅限研究使用（Research Use Only），不可用于临床诊断。

操作流程概述（典型步骤）

1. 准备试剂：将HDAC6酶、荧光底物及检测缓冲液从-80°C取出，冰上融化。

2. 配制反应混合液：根据说明书稀释HDAC6酶至工作浓度。

3. 酶反应：在微孔板中加入检测缓冲液、待测化合物（或抑制剂）、HDAC6酶和荧光底物，混匀后37°C孵育30-60分钟。

4. 显影：加入2× HDAC显影剂（含TSA），混匀后室温孵育10-15分钟。

5. 读数：使用荧光酶标仪在激发/发射波长360 nm/460 nm处读取荧光强度。

6. 数据分析：计算抑制率 =（1 - 样品荧光值 / 无抑制剂对照荧光值）× 100%，使用非线性回归拟合IC50曲线。

五、文献参考

1. Santo, L., et al., Blood. 2012 Mar 15;119(11):2579-89.

2. Bradner, J.E., et al., Nat Chem Biol. 2010 Mar;6(3): 238-243.