上海臻科生物科技有限公司

               安普霉素快速检测试剂盒

                           使用说明书

【测定原理】

        本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物安普霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗安普霉素抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物安普霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物安普霉素的含量。

【试剂盒技术指标】   

规      格：96孔/盒

灵 敏 度： 1ppb

检测时间： 45min

样本检测下限：

组织 ………………………………………40ppb

牛奶 ………………………………………40ppb

蜂蜜/蜂王浆………………………………20ppb

交叉反应率：

安普霉素……………………………………100%

卡拉霉素 …………………………………<1%

庆大霉素…………………………………<1%

样本回收率：

组织 …………………………………85%±10%

牛奶 …………………………………95%±15%

蜂蜜/蜂王浆…………………………75%±15%

【试剂盒组成】

1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）

2、 标准溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb

3、 高浓度标准品：×1瓶：（1ml/瓶）1ppm

4、 酶标记物       7ml………………………红色帽

5、 抗体工作液   7ml ………………………绿色帽

6、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

7、 底物B液     7ml  …………………… 黑色帽

8、 终  止  液     7ml  …………………… 黄色帽

9、 20X浓缩洗涤液40 ml  ……………… 白色帽

10、 2X 浓缩复溶液  50ml ·………………   蓝色帽

【 所用仪器、试剂】

具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、

                       刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮

                       吹仪、刻度移液管

微量移液器：单道 20μl～200μl、单道100μl～

                        1000μl、多道 30～300 μl

试           剂：浓磷酸、氢氧化钠、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、正己烷

u 样本前处理需配制：

配液1、将浓缩复溶液用去离子水按1：1稀释（1份浓缩复溶液+1份去离子水）。

配液2、0.01M PBS溶液

2.58gNa₂HPO₄·12H₂O+0.435gNaH₂PO₄·2H₂O  

+4.25gNaCL加去离子水定溶至1L。

配液3、0.04M磷酸溶液

1ml浓磷酸加去离子水定溶至360ml。

配液4、1M NaOH溶液

 称取4g NaOH加去离子水定溶至100ml。

配液5、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照

              1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按

             所需用量配制洗涤液。

【样本前处理步骤】

u 样本处理前须知

（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试

剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，

必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实

验结果。

u 样本处理：

（a）牛奶样本的处理方法

1、 取牛奶1ml，按1:39稀释，混合30s。（50 ul牛奶+1950 ul稀释后的复溶液）

2、 取50ul用于分析。

稀释倍数：40

（b）组织（鸡肉、鸡肝、猪肉、蛋类）样本的处理方法

1、 取2±0.05g匀浆样本与8ml 0.01M PBS缓冲液混合5min，置56℃水浴环境放置30min；

2、 室温4000r/min以上，离心10min；

3、 取1ml上清液加入1ml正己烷，充分混匀，室温4000r/min以上，离心5min

4、 去上层液体取50ul下层液，加入450ul 稀释后的复溶液混匀，混合30s；

5、 取50ul用于分析。样本稀释倍数：40

（c）蜂蜜、蜂王浆：

1、 称量2±0.05g 样本加入4ml 0.04M磷酸，振荡至完全溶解，

2、 室温4000r/min以上，离心5min，直至清亮。（蜂蜜样本可不用离心直接进行第3步）

3、 加入450ul 1M NaOH将PH值调至7-9之间.(蜂王浆样本需将全部上清移至另一干净离心管中调节PH值至7-9之间)

4、 室温4000r/min以上，离心5min ，直至清亮。

5、 取50ul上清液，加入450ul稀释后的复溶液混匀，混合30s；

6、 取50ul用于分析。

稀释倍数：20       检测下限：20ppb

【酶标免疫分析程序】

操作步骤：

1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品/样本50µl /孔，然后加酶标记物50μl/孔，再加入抗体工作液50µl/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25℃环境避光反应30分钟。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 显色：每孔加入底物A液50ul，再加底物B液50ul，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

7、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含安普霉素的含量成负相关。

1、粗略判定：

     用样本的平均吸光度值与标准吸光度值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.310， 样本2的吸光度值为0.820，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.610；1ppb为1.350；3ppb为1.030；9ppb为0.720； 27ppb为0.359；81ppb为0.198。则样本1的浓度范围是27ppb-81ppb； 样本2的浓度范围是3 ppb-9 ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中安普霉素实际含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以金刚烷胺浓度（ng /ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中金刚烷胺实际含量。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）   

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

                   1                   3                    9                    27                  81    

        金刚烷胺(ppb) [µg/kg]

图1：安普霉素检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

       0        1       3       9        27      81

安普霉素(ppb) [µg/kg]

图2：安普霉素检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出安普霉素检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应安普霉素浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】有效期12个月;生产日期、有效期、批号见外包装。