人肝癌细胞-荧光素酶标记;HEP3B-LUC-PURO

                                                          人肝癌细胞-荧光素酶标记;HEP3B-LUC-PURO
产品信息：

HEP3B-LUC-PURO细胞（人肝癌细胞-荧光素酶标记）是在经典的Hep 3B（人肝癌细胞）基础上，通过基因工程技术（通常是慢病毒转染）稳定整合了荧光素酶（Luciferase）报告基因和嘌呤霉素（Puromycin）抗性基因的双标记细胞系。

该细胞株不仅保留了母系细胞高表达甲胎蛋白（AFP）和乙肝表面抗原（HBsAg）的特性，还能持续发出生物荧光，是进行活体动物成像（IVIS）、肿瘤转移模型构建及抗肿瘤药物动态监测的理想模型。

1. 细胞基本特性与背景

亲本来源： 源自人肝癌细胞 Hep 3B（该细胞系建系于1979年，源自一位患有肝癌的7岁黑人男童）。

标记基因：

LUC： 萤火虫荧光素酶，用于生物发光检测。

Puro： 嘌呤霉素抗性基因，用于筛选和维持质粒稳定性。

细胞类型： 肿瘤细胞（肝癌细胞）。

生长特性： 贴壁生长。

细胞形态： 上皮细胞样。

关键特征： 该细胞含有乙型肝炎病毒（HBV）基因组，具有致瘤性，能产生甲胎蛋白（AFP）、白蛋白等。

应用领域： 仅限科研使用，主要用于肝癌机制研究、抗病毒/抗肿瘤药物筛选及活体成像。

2. 培养条件与完全培养基配置

Hep 3B-LUC 细胞的培养基配置通常沿用 Hep 3B 的培养条件，但为了维持标记基因的表达，通常需要添加抗生素筛选。

基础培养基： MEM (Minimum Essential Medium) 含NEAA（非必需氨基酸）。

添加成分：

胎牛血清 (FBS)： 10%。

双抗 (Penicillin-Streptomycin)： 1%。

谷氨酰胺 (GlutaMAX)： 1%（可选，但建议添加）。

嘌呤霉素 (Puromycin)： 1.0 - 2.0 μg/mL（用于维持筛选压力，防止荧光素酶基因丢失。具体浓度请参考供应商说明书）。

培养环境：

温度： 37℃。

气相： 5% CO，95% 空气。

湿度： 饱和湿度。

3. 详细培养操作指南

细胞复苏

快速解冻： 将冻存管从液氮中取出，迅速放入 37℃水浴 中，轻轻摇晃，使其在 1 分钟内完全融化。

稀释离心： 用酒精消毒管壁，将细胞悬液缓慢加入含 4-6 mL 预热完全培养基的离心管中混匀。1000 rpm 离心 3-5 分钟。

重悬接种： 弃去上清，加入含嘌呤霉素的完全培养基重悬细胞，接种到 T25 培养瓶中。

静置培养： 次日观察细胞贴壁情况，建议更换新鲜培养基以去除残留的 DMSO。

细胞传代（当细胞密度达 80%-90% 时）

弃液洗涤： 弃去旧培养基，用不含钙镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

消化： 加入 0.25% 胰蛋白酶（Trypsin-EDTA，约 1-2 mL），放入 37℃ 培养箱消化 1-3 分钟。

注意：Hep 3B 细胞贴壁较牢，且消化时极易受损，需在显微镜下密切观察，待细胞间隙变大、变圆脱落时立即终止消化。

终止消化： 加入含血清的培养基终止消化。

离心分瓶： 将细胞悬液转移至离心管，1000 rpm 离心 5 分钟。弃上清，加入新鲜完全培养基重悬，按 1:2 至 1:3 的比例分装传代。

细胞冻存

收集： 按传代步骤收集处于对数生长期的细胞。

冻存液： 推荐使用 90% FBS + 10% DMSO，或者专用的无血清冻存液。

程序降温： 将冻存管放入程序降温盒，置于 -80℃冰箱 过夜，第二天转入 液氮罐 长期保存。

4. 关键注意事项（必读）

荧光素酶表达稳定性（关键）：

为了维持 LUC 的稳定表达，建议在平时的培养基中维持 低浓度的嘌呤霉素筛选。

如果发现荧光强度减弱，可以进行高浓度嘌呤霉素的短期筛选以富集阳性细胞。

消化控制：

Hep 3B 细胞对消化非常敏感，消化过度会导致细胞死亡或生长缓慢。建议在细胞明显回缩、间隙变大但未完全脱落时即加入培养基吹打。

生物安全等级：

由于该细胞含有乙型肝炎病毒（HBV）基因组，属于 BSL-2 细胞，操作时需在生物安全柜中进行，并穿戴适当的防护装备（手套、实验服、护目镜）。

总结

HEP3B-LUC-PURO 是研究肝癌及进行活体成像的有力工具。培养它的核心在于严格控制消化时间（防止细胞受损）和维持抗生素筛选压力（以保证荧光素酶的持续表达）。只要掌握好这两点，它就能为你提供稳定的发光信号和可靠的实验数据。

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细胞具体特点如下：

环境与营养：需无菌环境、精确的温度（36-37℃）和pH（7.2-7.4），动物细胞常需血清，植物细胞需激素。

生长方式：贴壁细胞需表面附着，悬浮细胞自由漂浮，半贴壁半悬浮兼具两者特性。

传代与密度：贴壁细胞需胰酶消化传代，悬浮细胞直接分瓶；密度达80%-90%时需传代，避免营养枯竭与代谢抑制。

敏感性：对剪切应力、污染、温度变化敏感，需定期更换培养液清除代谢物。

应用与局限：便于活细胞观察与实验控制，但体外环境与体内存在差异，长期传代可能导致遗传不稳定与去分化。