胶冻样类芽孢杆菌探针法qPCR试剂盒

检测原理

基于TaqMan探针技术，通过5'核酸外切酶活性切割与靶序列结合的荧光标记探针。探针5'端标记报告基团（如FAM），3'端标记淬灭基团，PCR扩增时探针被切割，释放荧光信号，实时监测荧光强度实现定量分析。

产品组成

qPCR缓冲液（500μL）

酶混合液（含逆转录酶、Taq DNA聚合酶，100μL）

模板稀释液（1mL）

引物混合液（靶向P. mucilaginosus保守区，100μL）

探针（50μL，FAM标记）

阳性对照（1×10^8拷贝/μL，50μL）

说明书（1份）

操作步骤

1. 标准曲线制备（10倍梯度稀释）

标记离心管（6管），依次稀释阳性对照至10^1–10^6拷贝/μL，冰上保存。

2. 样本处理

RNA提取：推荐使用柱式提取法，阴性对照（NC）用水，阳性对照（PC）用稀释后的标准品。

体系配置（20μL/反应）：

| 成分 | 体积（μL） |

| qPCR缓冲液 | 10 |

| 酶混合液 | 2 |

| 引物混合液 | 2 |

| 探针 | 1 |

| 模板（样本/标准品）| 5 |

3. 扩增程序

| 步骤 | 温度 | 时间 |

| 逆转录 | 50℃ | 30 min |

| 预变性 | 94℃ | 10 min |

| 40循环 | 94℃ | 15 sec |

| | 60℃ | 1 min（采集荧光） |

数据分析

定量检测：以标准品log拷贝数为横轴、Ct值为纵轴绘制曲线，计算样本浓度。

定性检测：

阳性：Ct≤35，扩增曲线呈S型；

可疑（35<Ct<40）：需复测；

阴性：Ct≥40或无扩增。

注意事项

操作分区进行（试剂准备区、样本处理区、扩增区），避免污染。

探针避光保存，反复冻融≤3次。

仅限科研使用，不可用于临床诊断。

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