紫花地丁探针法PCR鉴定试剂盒

检测原理

基于实时荧光定量PCR（qPCR）技术，采用探针法（TaqMan原理）：

探针设计：5'端标记荧光报告基团（如FAM），3'端标记淬灭基团，探针与靶序列结合后被Taq酶切割，释放荧光信号。

定量分析：通过监测扩增过程中荧光强度的累积，实时计算Ct值，实现对目标RNA/DNA的定性和定量检测。

产品特点

高灵敏度：检测下限可达几百拷贝/反应。

高特异性：引物及探针针对紫花地丁保守序列设计，无交叉反应。

即开即用：预混缓冲液、酶及引物探针，用户仅需提供样品RNA。

内控设计：含阳性对照（无传染性DNA片段，1×10^8拷贝/μL）和阴性对照，避免假阴性。

一管式操作：闭管检测，减少污染风险。

试剂盒组成

| 成分 | 规格 | 功能说明 |

| qRT-PCR缓冲液 | 500μL | 反应体系基础液 |

| qRT-PCR酶混合液 | 100μL | 含逆转录酶及Taq酶 |

| 引物混合液 | 100μL | 特异性扩增紫花地丁序列 |

| 荧光探针 | 50μL | 靶标检测探针 |

| 阳性对照 | 50μL (1×10^8拷贝/μL) | 标准曲线制备 |

| 模板稀释液 | 1 mL | 标准品稀释 |

操作步骤

1. 标准曲线制备（6个梯度稀释，10^2~10^7拷贝/μL）：

依次将阳性对照稀释至所需浓度，独立操作避免污染。

2. 样品RNA提取：

使用兼容的RNA提取试剂盒，建议设置阴性/阳性对照。

3. qRT-PCR反应体系（20μL）：

| 成分 | 体积（μL） |

| 缓冲液 | 10 |

| 酶混合液 | 2 |

| 引物混合液 | 2 |

| 探针 | 1 |

| 样品RNA/标准品 | 5 |

4. 反应程序：

逆转录：50℃ 30 min

预变性：94℃ 10 min

扩增（40循环）：94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集FAM信号）

数据分析

定量检测：以标准曲线log值为横轴，Ct值为纵轴，计算样品浓度。

定性检测：

阳性：Ct ≤ 35，扩增曲线呈S型；

阴性：Ct ≥ 40或无扩增；

可疑（35<Ct<40）：需复测确认。

注意事项

分区操作（样本处理、试剂配制、扩增区），避免交叉污染。

使用带滤芯枪头，所有试剂完全融化并混匀后离心。

阳性对照需最后加入，防止气溶胶污染。

废弃物质需经消毒处理（如10%次氯酸）。

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