乙酰辅酶A测试盒

乙酰辅酶A测试盒

测定意义与原理

测定意义

乙酰辅酶A是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于ATP合成。此外，乙酰辅酶A是合成脂肪酸、酮体、胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。其活性测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测线粒体疾病、神经系统疾病、心血管疾病等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解线粒体功能、细胞凋亡和细胞增殖机制药物研发：筛选线粒体靶向药物，用于治疗线粒体疾病和神经退行性疾病环境监测：评估环境污染对生物线粒体的影响

测定原理

苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD+生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶A含量的高低。反应式如下： 苹果酸+NAD+→苹果酸脱氢酶草酰乙酸+NADH+H+苹果酸+NAD+苹果酸脱氢酶草酰乙酸+NADH+H+ 乙酰辅酶A+草酰乙酸→柠檬酸合酶柠檬酸+CoA乙酰辅酶A+草酰乙酸柠檬酸合酶柠檬酸+CoA

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

提取液一 液体30mL×1瓶 用于提取样本中的乙酰辅酶A

提取液二 液体300μL×1支 含稳定剂，用于保护乙酰辅酶A活性

试剂一 粉剂×1支 含苹果酸脱氢酶，反应辅助因子

试剂二 液体10μL×1支 含柠檬酸合酶，反应辅助因子

试剂三A 液体25mL×1瓶 含缓冲液，用于配制工作液

试剂三B 粉剂×1瓶 含NAD+溶液，反应底物

试剂四 液体5mL×1瓶 含苹果酸溶液，反应底物

标准品 液体×1支 含乙酰辅酶A标准液，用于建立标准曲线

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度法：紫外分光光度计、1mL石英比色皿

微量法：酶标仪、96孔板

通用：台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、三氯乙酸

样本前处理方法

动植物组织样本取样：准确称取0.1g组织，用生理盐水洗净表面杂质，用滤纸吸干匀浆：加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆离心：8000g，4℃离心10min，弃沉淀，保留上清液检测：上清液用于乙酰辅酶A含量测定

细胞/细菌样本收集：收集500万细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清破碎：加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本

血清/血浆样本可直接检测；若液体有浑浊则离心后测定

测定操作步骤

溶液配制试剂一：临用前加入325μL试剂四，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融试剂二：临用前取1支先将液体甩离至管底，然后加入250μL试剂四，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融试剂三：临用取试剂三B加入24mL试剂三A，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融工作液：临用前将试剂一、二和三按照1:1:90的比例混合，根据样本量现配现用

测定操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，用蒸馏水调零工作液预热：将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min样品测定：

取1mL石英比色皿，加入0.2mL样本溶液和0.82mL工作液，迅速混匀

立即在340nm测定20s和80s的光吸收值A1和A2，计算ΔA=A2-A1标准曲线绘制：

将标准品稀释成0、10、20、30、40、50μmol/L系列浓度

同样处理，测定1min内吸光值变化，绘制标准曲线

结果计算方法

单位定义

nmol/g 质量：每克样本中乙酰辅酶A的含量

nmol/10⁴ cell：每10000个细胞中乙酰辅酶A的含量

nmol/mL：每毫升样本中乙酰辅酶A的含量

计算公式

乙酰辅酶A含量(nmol/g质量)=ΔA×V反ε×d×V样×W×109×F乙酰辅酶A含量(nmol/g质量)=ε×d×V样×WΔA×V反×109×F

ΔA：1min内吸光度变化值

V反：反应体系总体积（L）

ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

V样：样本体积（L）

W：样本质量（g）

F：稀释倍数

简化公式： 乙酰辅酶A含量(nmol/g质量)=819.9×ΔA÷W×F乙酰辅酶A含量(nmol/g质量)=819.9×ΔA÷W×F 乙酰辅酶A含量(nmol/10⁴ cell)=1.640×ΔA×F乙酰辅酶A含量(nmol/10⁴ cell)=1.640×ΔA×F 乙酰辅酶A含量(nmol/mL)=819.9×ΔA×F乙酰辅酶A含量(nmol/mL)=819.9×ΔA×F

性能指标

指标 紫外分光光度法 微量法

线性范围 0~50μmol/L 0~50μmol/L

最低检测限 ≤0.1μmol/L ≤0.1μmol/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免乙酰辅酶A降解；-20℃可保存3个月

操作过程需在4℃冰浴中进行，避免酶失活

若样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测

试剂使用：

试剂临用前配制，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存，避免反复冻融

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

加入样品启动反应后需立即进行比色测定，确保数据准确

比色测定初始读数（20秒读数）0.4左右为理想状态

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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