脯氨酸（PRO）含量测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

脯氨酸（Proline，PRO）是一种重要的有机渗透调节物质，在生物体内具有多方面的功能：渗透调节：在逆境条件下，脯氨酸大量积累，维持细胞渗透压稳定，防止水分流失抗氧化作用：清除自由基，保护细胞膜和蛋白质免受氧化损伤氮源储存：作为氮的储存形式，在需要时可分解提供氮源疾病诊断：某些疾病（如高脯氨酸血症）患者血液中脯氨酸含量显著升高食品品质评价：反映食品的新鲜度、加工过程和营养价值

测定原理

采用茚三酮比色法，脯氨酸在酸性条件下与茚三酮反应生成红色复合物，该复合物在520nm处有最大吸收峰，吸光度与脯氨酸浓度成正比。反应式如下： 脯氨酸+茚三酮→酸性条件、加热红色复合物脯氨酸+茚三酮酸性条件、加热红色复合物

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

试剂A 液体25mL×1瓶 含3%茚三酮的乙酸-高氯酸混合液，与脯氨酸反应生成红色复合物

试剂B 液体10mL×1瓶 含冰乙酸溶液，用于反应体系构建

试剂C 液体100mL×1瓶 含3%磺基水杨酸溶液，用于样本提取

标准品 液体1mL×1支 含100μg/mL脯氨酸标准品，用于建立标准曲线

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法：可见分光光度计、台式高速离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿

HPLC法：高效液相色谱仪、紫外检测器、C18色谱柱

通用：-20℃冰箱、电子天平、恒温水浴锅、沸水浴装置

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、移液管

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、乙酸乙酯

样本前处理方法

植物组织样本取新鲜植物组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分按质量(g):提取液(mL)=1:5~10比例（建议0.1g组织加1mL提取液）冰浴匀浆沸水浴中加热10min，冷却后8000g离心10min，取上清置冰上待测若脯氨酸含量过高，可用提取液稀释1-5倍测定

细胞/细菌样本收集对数生长期细胞/细菌，8000g 4℃离心5min弃上清按细胞数(10⁴个):提取液(mL)=500~1000:1比例加入提取液，冰浴超声破碎沸水浴中加热10min，冷却后8000g离心10min，取上清置冰上待测

食品/农产品样本水果/蔬菜：洗净切块，加入预冷提取液（1:5~10W/V），冰浴匀浆，沸水浴加热10min粮食/种子：研碎后加入10倍体积的提取液，沸水浴加热10min，过滤或离心取上清加工食品：固体食品磨碎后用提取液提取，液体食品直接沸水浴加热10min

测定操作步骤

比色法操作

试剂准备：

将试剂盒平衡至室温（20-25℃）

配制工作液：取试剂A 5mL + 试剂B 5mL，充分混匀

标准品稀释：将100μg/mL脯氨酸标准品用提取液稀释成0、2、4、6、8、10μg/mL的标准系列

标准曲线建立：

取比色管，加入标准品溶液0.5mL + 工作液0.5mL

沸水浴中加热30min，立即冰浴冷却

加入甲苯2.0mL，漩涡混匀，静置分层

取甲苯层，在520nm波长下测定吸光度

以脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线

样本测定：

分光光度计预热30min，520nm波长，甲苯调零

测定管：取比色管，加入样本0.5mL + 工作液0.5mL

空白管：取比色管，加入提取液0.5mL + 工作液0.5mL

沸水浴中加热30min，立即冰浴冷却

加入甲苯2.0mL，漩涡混匀，静置分层

取甲苯层，测定吸光度（A样、A空）

HPLC法操作

色谱条件：

色谱柱：C18柱（4.6×250mm，5μm）

流动相：甲醇-水（60:40，v/v）

流速：1.0mL/min

检测波长：520nm

柱温：30℃

进样量：20μL

样本前处理：

取样本0.5mL，加入茚三酮试剂0.5mL，沸水浴加热30min

冷却后用乙酸乙酯萃取，取有机相氮气吹干，用甲醇复溶

0.22μm滤膜过滤，进样分析

结果计算方法

单位定义

μg/g鲜重：每克组织鲜重中脯氨酸的含量

μg/mL：每毫升样本中脯氨酸的含量

比色法计算公式

脯氨酸含量(μg/g鲜重)=(A样−A空)×C标×V总×D(A标−A空标)×W脯氨酸含量(μg/g鲜重)=(A标−A空标)×W(A样−A空)×C标×V总×D

A样-A空：样本扣除空白后的吸光度值

C标：标准品浓度（μg/mL）

V总：样本提取液总体积（mL）

D：样本稀释倍数（未稀释则为1）

A标-A空标：标准品扣除空白后的吸光度值

W：组织鲜重（g）

简化公式

按鲜重计算：脯氨酸（μg/g鲜重）= C标 × (A样-A空)/(A标-A空标) × V总/W

按液体体积计算：脯氨酸（μg/mL）= C标 × (A样-A空)/(A标-A空标) × D

HPLC法计算以外标法或内标法定量，根据标准品峰面积计算脯氨酸含量结果转换为相应单位

性能指标

指标 要求

线性范围 0~10μg/mL，线性相关系数r≥0.995

最低检测限 ≤0.1μg/mL

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免脯氨酸分解；-80℃可保存1个月

匀浆与沸水浴需严格控制时间，避免样本过度氧化

样本需充分提取，确保脯氨酸完全释放

试剂使用：

茚三酮溶液对光敏感，配制后需避光保存

标准品需现配现用，避免降解

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

沸水浴时间需严格控制在30min，避免显色过度

冷却需迅速，避免红色复合物分解

萃取时需充分混匀，确保红色复合物完全转移到甲苯层

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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