蛋白质羰基测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

蛋白质羰基（Protein Carbonyl）是蛋白质氧化损伤的重要生物标志物：氧化应激标记：直接反映蛋白质被活性氧（ROS）氧化的程度疾病关联：与衰老、神经退行性疾病（阿尔茨海默病、帕金森病）、糖尿病、心血管疾病、癌症等密切相关环境胁迫响应：评估生物对辐射、重金属、化学毒素等环境压力的响应药物研发：作为抗氧化药物筛选和疗效评价的重要指标

测定原理

采用2,4-二硝基苯肼（DNPH）比色法，DNPH与蛋白质羰基反应生成稳定的2,4-二硝基苯腙，在370nm处有特征吸收峰，吸光度与蛋白质羰基含量成正比： 蛋白质-CO+DNPH→蛋白质-C=N-NH-C6H3(NO2)2+H2O蛋白质-CO+DNPH→蛋白质-C=N-NH-C6H3(NO2)2+H2O

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

试剂A 液体25mL×1瓶 含10mmol/L DNPH的2mol/L盐酸溶液，与羰基反应生成腙类化合物

试剂B 液体10mL×1瓶 含2mol/L盐酸溶液，用于空白对照

试剂C 液体100mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.4，用于样本提取

试剂D 液体50mL×1瓶 含20%三氯乙酸（TCA）溶液，用于蛋白质沉淀

试剂E 液体25mL×1瓶 含乙醇-乙酸乙酯混合液（1:1，v/v），用于沉淀洗涤

试剂F 液体10mL×1瓶 含6mol/L盐酸胍溶液，用于溶解蛋白质腙沉淀

标准品 液体1mL×1支 含10mmol/L蛋白质羰基标准品，用于建立标准曲线

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法：可见分光光度计、台式高速离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、漩涡混匀器

HPLC法：高效液相色谱仪、紫外检测器、C18色谱柱

通用：-20℃冰箱、电子天平、恒温水浴锅

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、抗凝剂（肝素/EDTA）

样本前处理方法

动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分按质量(g):提取液(mL)=1:5~10比例（建议0.1g组织加1mL提取液）冰浴匀浆8000g 4℃离心15min，取上清置冰上待测测定样本蛋白浓度，调整蛋白浓度在1-5mg/mL范围内

细胞/细菌样本收集对数生长期细胞/细菌，8000g 4℃离心5min弃上清按细胞数(10⁴):提取液(mL)=500~1000:1比例加入提取液，冰浴超声破碎8000g 4℃离心15min，取上清置冰上待测测定样本蛋白浓度，调整蛋白浓度在1-5mg/mL范围内

液体样本（血清/血浆/尿液/唾液等）血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清直接测定血浆样本：加入肝素/EDTA抗凝后，3000g 4℃离心10min，取上清直接测定尿液/唾液：新鲜样本3000g 4℃离心10min，取上清直接测定测定样本蛋白浓度，调整蛋白浓度在1-5mg/mL范围内

测定操作步骤

分光光度法操作

试剂准备：

试剂A：液体25mL×1瓶，2-8℃保存，避光

试剂B：液体10mL×1瓶，2-8℃保存

试剂C：液体100mL×1瓶，2-8℃保存

试剂D：液体50mL×1瓶，2-8℃保存

试剂E：液体25mL×1瓶，2-8℃保存

试剂F：液体10mL×1瓶，2-8℃保存

反应步骤：

测定管：取样本0.5mL，加入试剂A 0.5mL，室温避光反应1h

空白管：取样本0.5mL，加入试剂B 0.5mL，室温避光反应1h

蛋白质沉淀与洗涤：

两管分别加入试剂D 1.0mL，漩涡混匀，4℃放置10min

8000g 4℃离心10min，弃上清，保留蛋白质沉淀

加入试剂E 2.0mL，漩涡混匀，洗涤沉淀，8000g 4℃离心10min，弃上清

重复洗涤步骤2-3次，以去除未反应的DNPH

溶解与测定：

两管分别加入试剂F 1.0mL，漩涡混匀，37℃水浴10min，使沉淀完全溶解

8000g 4℃离心5min，取上清液，在370nm波长下测定吸光度（A样、A空）

同时用试剂F调零

HPLC法操作

色谱条件：

色谱柱：C18柱（4.6×250mm，5μm）

流动相：甲醇-水（60:40，v/v），含0.1%三氟乙酸

流速：1.0mL/min

检测波长：370nm

柱温：30℃

进样量：20μL

样本前处理：

取样本0.5mL，加入DNPH试剂0.5mL，室温避光反应1h

蛋白质沉淀、洗涤后，用盐酸胍溶解

0.22μm滤膜过滤，进样分析

结果计算方法

单位定义

nmol/mgprot：每毫克蛋白质中蛋白质羰基的含量

nmol/mL：每毫升样本中蛋白质羰基的含量

分光光度法计算公式

蛋白质羰基含量(nmol/mgprot)=(A样−A空)×V总ε×Cpr×V样蛋白质羰基含量(nmol/mgprot)=ε×Cpr×V样(A样−A空)×V总

A样-A空：样本扣除空白后的吸光度值

V总：最终溶解液体积（1.0mL）

ε：摩尔消光系数（22,000 L/(mol·cm)）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样：样本初始体积（0.5mL）

简化公式

按蛋白含量计算：蛋白质羰基（nmol/mgprot）= 4.5×(A样-A空)÷Cpr

按液体体积计算：蛋白质羰基（nmol/mL）= 4.5×(A样-A空)

HPLC法计算以外标法或内标法定量，根据标准品峰面积计算蛋白质羰基含量结果以nmol/mgprot或nmol/mL表示

性能指标

指标 要求

线性范围 0~10nmol/mgprot，线性相关系数r≥0.995

最低检测限 ≤0.1nmol/mgprot

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免蛋白质进一步氧化；-80℃可保存1个月

样本处理过程中需避免接触金属离子、强光和高温

样本蛋白浓度需调整在1-5mg/mL范围内，确保反应完全

试剂使用：

DNPH试剂对光敏感，配制后需避光保存

盐酸胍溶液需现配现用，避免分解

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应需在室温避光条件下进行，避免阳光直射

沉淀洗涤需彻底，以去除未反应的DNPH，否则会导致结果偏高

溶解沉淀时需确保完全溶解，否则会导致结果偏低

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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