Recombinant Human HERC3 新品

Recombinant Human HERC3

Recombinant Human HERC3（人HERC3重组蛋白）是一种在大肠杆菌中表达的高纯度重组蛋白，作为HECT结构域E3泛素连接酶家族成员，通过调控YAP/TAZ或EIF5A2等底物的稳定性，参与肿瘤发生发展及上皮-间质转化过程的研究。

商品介绍：

别称：HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 3, HECT domain and RCC1 like domain containing protein 3, Hect domain and RLD 3, HERC 3, KIAA0032, Probable E3 ubiquitin protein ligase HERC3

标签：N-terminal His Tag

种属：Human

宿主：E.Coli

表达区间：232-358

分子量：13.9kDa

应用：Western Blot, ELISA

性状：Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in 10 mM Hepes, 500 mM NaCl with 5% trehalose, pH7.4

纯度：Greater than 95% by SDS-PAGE gel analyses

溶解方法:Centrifuge the vial at 10,000 rpm for 1 minute, reconstitute at 200 μg/ml in sterile distilled water by gentle pipetting 2-3 times, don’t vortex

存储:-20°C for 12 months as lyophilized; 2-8°C for 1 month under sterile conditions after reconstitution

检测原理详解：

包被抗体结合

实验开始前，微孔板已预先包被?抗人白脂素单克隆抗体。当加入待测样本后，样本中的人白脂素（Asprosin）

会与固相载体上的捕获抗体特异性结合。

形成“夹心复合物”

洗涤去除未结合物质后，加入?生物素标记的检测抗体，该抗体与白脂素分子的另一表位结合，形成“固相抗体

—抗原—检测抗体”三明治结构。

酶促显色反应

随后加入?辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，与生物素检测抗体结合。最后加入TMB显色底物，在

HRP催化下产生蓝色产物，反应终止后变为黄色。

浓度定量分析

黄色深浅与样本中白脂素含量成正比，通过酶标仪在450nm波长处测定吸光度（OD值），并根据标准曲线计

算出样本中白脂素的浓度。

公司正在出售的产品：

1. 基因克隆与表达载体构建

从人类FBN1基因C端序列中扩增?Asprosin编码片段（约140aa）。

将目的片段插入原核表达载体，确保带有?N端或C端His标签，便于后续纯化。

转化至?感受态细胞，筛选阳性克隆并测序验证。

2. 重组蛋白诱导表达

取阳性菌落接种于LB培养基（含氨苄青霉素），37℃振荡培养过夜。

次日按1:100比例转接至新鲜LB培养基，37℃培养至OD600达0.6–0.8。

加入?IPTG至终浓度0.1–1.0 mM?，?16–25℃诱导表达6–12小时（低温诱导有助于可溶性表达）。

4℃、8000×g离心10分钟收集菌体，弃上清，-20℃保存备用。

3. 菌体裂解与蛋白提取

将菌体沉淀重悬于?裂解缓冲液（如PBS + 1% Triton X-100 + 蛋白酶抑制剂），超声破碎（冰浴条件下，每次30秒，共6–10次，功率30%）。

4℃、12000×g离心20分钟，收集上清（可溶性蛋白）或沉淀（包涵体蛋白）。

若为包涵体蛋白，需用?洗涤缓冲液（含2M尿素的PBS）洗涤2–3次，去除杂蛋白。

4. 亲和层析纯化（Ni-NTA法）

将含His标签的蛋白溶液（或溶解后的包涵体蛋白，使用含6–8M尿素的缓冲液溶解）上样至?Ni-NTA亲和层析柱。

用?洗涤缓冲液（含20–40mM咪唑）洗去非特异性结合蛋白。

用?洗脱缓冲液（含250–500mM咪唑）梯度洗脱目标蛋白，收集洗脱峰。

透析去除尿素与咪唑（使用PBS或生理缓冲液，4℃过夜，更换3次）。

5. 蛋白复性（针对包涵体蛋白）

若蛋白以包涵体形式表达，需在纯化后进行?梯度复性：

将变性蛋白缓慢加入含?梯度降低尿素?（6M → 4M → 2M → 0M）的复性缓冲液中，4℃搅拌过夜。

或采用?透析法?逐步去除变性剂。

复性后再次离心取上清，检测蛋白活性。