Bsu DNA聚合酶 大片段

基本信息‌

‌英文名称‌：Bsu DNA Polymerase, Large Fragment
作用机制：Bsu DNA聚合酶的N端缺失突变体，具有5'→3' DNA聚合酶活性与3'→5'外切酶活性；可用于DNA片段的扩增、平末端修复、DNA测序等实验；具有热稳定性，可在高温条件下进行反应。 

适用样本：DNA片段的PCR扩增、平末端修复、DNA测序等实验，尤其适用于高温条件下的DNA合成。
产品概述
Bsu DNA聚合酶大片段是从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中分离得到的DNA聚合酶的大片段形式，经过基因工程改造去除了5'→3'核酸外切酶活性，但保留了5'→3'DNA聚合酶活性与3'→5'核酸外切酶活性（校对活性）。它能够以DNA为模板，催化脱氧核糖核苷酸（dNTP）聚合形成新的DNA链，且具有较高的保真性，可有效减少DNA复制过程中的碱基错配。Bsu DNA聚合酶大片段在分子生物学实验中有多种应用，如PCR扩增、DNA测序、定点突变、DNA片段填充、平末端化等。其校对活性使其在需要高保真性DNA合成的实验中具有优势，如高保真PCR、长片段DNA扩增、基因克隆等场景。此外，该酶对热稳定性较高，可在PCR反应的高温循环条件下保持活性。
产品特点
高保真性：具有3'→5'核酸外切酶校对活性，错配率低，适合高保真PCR扩增。

链置换活性：具有较强的链置换能力，可用于等温扩增、滚环扩增等特殊PCR反应。

热稳定性好：耐受95℃高温处理，适合常规PCR的高温循环反应。

产物长度长：可扩增长达10kb的DNA片段，满足长片段扩增需求。

反应条件宽松：在较宽的温度范围（55-72℃）和pH范围（7.0-9.0）内均有活性。
操作步骤

样本处理：向1.5ml EP管中加入600μl miRNA提取试剂，再加入500μl血清或血浆样本，漩涡振荡30秒充分混匀

初步分离：13000rpm离心5分钟，将上清约1ml转移至新的2ml EP管中，加入1ml异丙醇，上下颠倒混合均匀

柱式吸附：将混合液分三次加入吸附柱（每次约700μl），13000rpm离心15秒，倒掉过柱液

洗涤纯化：

向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇，13000rpm离心15秒，倒掉过滤液

向吸附柱中加入500μl无水乙醇，13000rpm离心15秒，倒掉过滤液

干燥柱体：吸附柱13000rpm空离心2分钟，去除残留乙醇，室温放置2分钟使乙醇完全挥发

RNA洗脱：在吸附柱滤芯中央加入30μl RNase-Free TE缓冲液，室温静置2分钟，13000rpm离心2分钟，收集滤液即为提取的miRNA产物

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注意事项

样本处理：

血浆抗凝剂建议使用EDTA或柠檬酸钠，避免使用肝素（会抑制PCR检测）

样本应避免反复冻融，新鲜样本建议尽快处理

试剂使用：

miRNA提取试剂含有胍盐，具有强烈腐蚀性，操作时需佩戴防护眼镜、手套和口罩

自备试剂需确保无RNase污染，避免影响RNA完整性

实验操作：

所有操作需在无RNase环境中进行，使用RNase-Free的枪头和离心管

离心过程需确保离心管盖紧，避免液体渗漏

产物检测：

由于血清/血浆中miRNA含量极低，提取产物浓度通常在5ng/μl以下，难以用常规NanoDrop测量，建议直接取10μl进行下游反转录实验

为获得更可靠数据，推荐使用特异性和灵敏度更好的TaqMan探针法进行miRNA定量检测

产物保存：提取的miRNA产物可立即用于下游实验，或分装后置于-80℃长期保存，避免反复冻融