Recombinant Human KCTD5 新品

Recombinant Human KCTD5

Recombinant Human KCTD5 (BTB/POZ Domain-Containing Protein 5) 是一种在大肠杆菌（E. coli）中表达的、带有 N 端标签的人源重组蛋白，表达区间为氨基酸 2-234，分子量约为 26.1 kDa。该蛋白纯度经 SDS-PAGE 检测大于 85%，以冻干粉形式提供，主要用于研究其作为 Cullin-3 E3 泛素连接酶底物适配器在 GPCR 信号通路中的负调控机制。

商品介绍：

别称：BTB/POZ domain-containing protein KCTD5, FLJ20040, KCTD5, KCTD5_HUMAN, Potassium channel tetramerisation domain containing 5

标签：N-terminal His Tag

种属：Human

宿主：E.Coli

表达区间：1-234

分子量：25.6 kDa

应用：Western Blot, ELISA

性状：Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in 10 mM Hepes, 500 mM NaCl with 5% trehalose, pH7.4

纯度：Greater than 95% as determined by SDS-PAGE

溶解方法:Centrifuge the vial at 10,000 rpm for 1 minute, reconstitute at 200 μg/ml in sterile distilled water by gentle pipetting 2-3 times, don’t vortex

存储:-20°C for 12 months as lyophilized; 2-8°C for 1 month under sterile conditions after reconstitution

检测原理详解：

包被抗体结合

实验开始前，微孔板已预先包被抗人白脂素单克隆抗体。当加入待测样本后，

样本中的人白脂素（Asprosin）会与固相载体上的捕获抗体特异性结合。

形成“夹心复合物”

洗涤去除未结合物质后，加入生物素标记的检测抗体，该抗体与白脂素分子的另一表位结合，

形成“固相抗体—抗原—检测抗体”三明治结构。

酶促显色反应

随后加入?辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，与生物素检测抗体结合。

最后加入TMB显色底物，在HRP催化下产生蓝色产物，反应终止后变为黄色。

浓度定量分析

黄色深浅与样本中白脂素含量成正比，通过酶标仪在450nm波长处测定吸光度（OD值），

并根据标准曲线计算出样本中白脂素的浓度。

公司正在出售的产品：

1. 基因克隆与表达载体构建

从人类FBN1基因C端序列中扩增Asprosin编码片段（约140aa）。

将目的片段插入原核表达载体，确保带有?N端或C端His标签，便于后续纯化。

转化至?感受态细胞，筛选阳性克隆并测序验证。

2. 重组蛋白诱导表达

取阳性菌落接种于LB培养基（含氨苄青霉素），37℃振荡培养过夜。

次日按1:100比例转接至新鲜LB培养基，37℃培养至OD600达0.6–0.8。

加入IPTG至终浓度0.1–1.0 mM，16–25℃诱导表达6–12小时（低温诱导有助于可溶性达）。

4℃、8000×g离心10分钟收集菌体，弃上清，-20℃保存备用。

3. 菌体裂解与蛋白提取

将菌体沉淀重悬于裂解缓冲液（如PBS + 1% Triton X-100 + 蛋白酶抑制剂），超声破碎

（冰浴条件下，每次30秒，共6–10次，功率30%）。

4℃、12000×g离心20分钟，收集上清（可溶性蛋白）或沉淀（包涵体蛋白）。

若为包涵体蛋白，需用?洗涤缓冲液（含2M尿素的PBS）洗涤2–3次，去除杂蛋白。

4. 亲和层析纯化（Ni-NTA法）

将含His标签的蛋白溶液（或溶解后的包涵体蛋白，使用含6–8M尿素的缓冲液溶解）上样至?Ni-NTA亲和层析柱。

用?洗涤缓冲液（含20–40mM咪唑）洗去非特异性结合蛋白。

用?洗脱缓冲液（含250–500mM咪唑）梯度洗脱目标蛋白，收集洗脱峰。

透析去除尿素与咪唑（使用PBS或生理缓冲液，4℃过夜，更换3次）。

5. 蛋白复性（针对包涵体蛋白）

若蛋白以包涵体形式表达，需在纯化后进行?梯度复性：

将变性蛋白缓慢加入含?梯度降低尿素（6M → 4M → 2M → 0M）的复性缓冲液中，4℃搅拌过夜。或采用?透析法?逐步去除变性剂。复性后再次离心取上清，检测蛋白活性。